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紧张素Ⅱ 1 型受体拮抗剂对小鼠肾脏的保护作用机制。
1材料与方法
1.1实验动物 清洁级雄性 SD 大鼠 18 只, 体重 180±20g , 在温州医学院实验动物中心饲养, 人工光照, 阴暗各 12h, 自由饮食。 动物许可证号:SYXK(浙)2005-0061 。
1.2实验药物与试剂 缬沙坦胶囊(北京诺华制药公司, 药准字 H20040217);Ang Ⅱ 放elisa免试剂盒;鼠抗人 TG F-β1 、a-SM A 单克隆抗体;山羊抗鼠 IgG抗体;免疫组化检测试剂盒、DA B显色剂。
1.3造模与分组 模型制作:用 3 戊巴比tuo钠按 0.15mL· kg -1 的剂量麻醉大鼠后, 行左侧输尿管结扎术。 步骤:背部肋脊角处做一纵行切口, 长约 2～ 3cm(与背部正中线平行), 夹住脂肪组织 , 取出肾脏, 将其翻向脊柱侧, 以生理盐水纱布覆
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结果
M asson 染色显示假手术组肾脏未见明显病变(见图 1A , 表 1);U UO 术后第二十八天, 梗阻侧肾组织肾小管间质大部分已纤维化(见图 1B, 表 1), U U O 组与假手术组比较有非常显著统计学意义 P <0.01 ;缬沙坦组部分近端小管上皮细胞空泡变性, 管腔内可见脱落坏死的上皮细胞, 远端肾小管扩张。 但是纤维化程度较 U UO 组轻(见图 1C , 表 1), 二者比较有非常显著统计学意义 P <0.01 。免疫组化显示假手术组大鼠肾间质只有极少量的 T GF-β1 、α-SM A 阳性表达(见图 1D 、图 1G , 表 1), 模型组大鼠 TG F-β1 、α-SMA 阳性表达与假手术组比较显著增多(见图 1E、图 1H , 表 1)(P <0.01);缬沙坦组 TGF-β1 、α-SM A 阳性表达也较模型组明显减少(见图 1F 、图 1I , 表 1)(P <0.01)。
表 1 3 组病理 M ASSON 染色以及Ang Ⅱ 、TG F-β1 和α-SM A 比较

盖, 暴露肾蒂, 分离出输尿管, 12 只在中 2/ 3 与下 1/ 3 处, 用 0
号线上下结扎两次, 中间剪断输尿管。 提起切口处皮肤肌肉,

组别 纤维化指数

Ang Ⅱ (ng·L -1)

α-SM A
(阳性 )

TG F-β 1
(阳性 )

使肾脏回纳原位, 分层缝合肌肉、皮肤层, 随机分为模型组予以生理盐水 1 日 1mL 灌胃;缬沙坦组为成人单位剂量的 10
倍(给药量为 12mg/ (K g·d) ;假手术组 6 只:剖开大鼠腹腔,
分离出左侧输尿管后, 不结扎, 分层缝合, 予以生理盐水 1 日
1mL 灌胃。 疗程 1 个月。
1.4指标检测 在 U U O 术后治疗 4 周, 处死全部大鼠, 腹主动脉采血分离血浆,-80℃冰箱保存。 采用放射免疫分析法测定血浆 Ang Ⅱ 水平, 取冻存全部血浆标本, 严格按照上海劲马生物科技有限公司 Ang Ⅱ 放免试剂盒说明书冰浴下检测血浆Ang Ⅱ 水平。 所有标本均同批检测。 取术侧肾组织置于10 福尔马林固定液中, 石蜡包埋切片, 行 M asson 染色观察肾小管间质病变, 免疫组化染色观察 a-SM A 及 T GF-β1 在肾间质的表达, 并应用图像分析系统进行半定量分析。
1.5病理观察 肾组织 M asson 染色, 光镜观察。 在 PAS- 9000 高清晰度数码显微图像分析系统下计算肾小管间质纤维化指数。 高倍镜(×200)下随机选取 6 个不重叠视野测定小管间质纤维化面积与同视野小管间质总面积的百分比, 进
行半定量评分。评分标准:0 分:无病变;1 分:<25 ;2 分: 26 ～ 50 ;3 分:>50 。 每张切片取 6 个视野的平均积分, 再在各组取平均值。
1.6免疫组织化学检测 免疫组化 T GF-β1 、a-SM A 采用 A BC 法:石 蜡切片脱蜡, 水化后, 用 0.075 胰酶于 37 ℃, 15min 或采用微波进行抗原修复, 一抗工作浓度为 1∶600 ～ 1000。 应用 DAB(二氨基联苯胺)显色。 常规脱水、透明、中性树胶封片, 镜检, 在 400 倍光镜下观察、记录免疫组化结果, 棕黄色为阳性染色。 在每张切片不包含肾小球和血管的间质区域随机选取 20 个高倍镜视野(X200, HPF), 用 Niko n E- clipse 80i Nis-Elements image softmare 分析系统对所选取视野中免疫组化阳性信号进行图像分析 , 计算每个视野中阳性染色面积占总视野面积的百分比。
1.7统计方法 实验数据以(x ±s)表示, 多组间比较采用单因素方差分析(one-w ay ANO VA), 所有统计学处理均由 SPSS 16.0 软件完成, P <0.05 为有统计学意义。