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    哪些因素决定了PCR反应的特异性

    点击次数:1164  更新时间:2023-11-11
    PCR反应的特异性决定因素为:
    ①引物与模板DNA特异正确的结合;
    ②碱基配对原则;
    ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;
    ④靶基因的特异性与保守性。
    PCR实验方法步骤:
    方法
    1:在冰浴中,产品仅用于科研按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
    10×PCR buffer                   
    5μl     dNTP mix (2mM)             
    4μl     引物1(10pM)                 
    2μl     引物2(10pM)                 
    2μl     Taq酶 (2U/μl)               
    1μl     DNA模板(50ng-1μg/μl) 
    1μl     加ddH2O至 50 μl 
    视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
    2:调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,在72℃ 保7min。
    3:伴放线放线杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
    4:PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μl进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。
    注意事项:
    1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行,设立一个的PCR实验室。
    2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。
    3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染,产品仅用于科研操作过程中均应戴手套。
    4.PCR试剂配制应使用高质量的新鲜双蒸水,采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
    5.试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后分装成仅够一次使用的量储存,从而确保实验与实验之间的连续性。
    6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
    7.PCR的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀。
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