收到细胞后,首先观察瓶身是否完好(注意有无缝隙,裂痕);显微镜下观察细胞的生长状况,有无细胞漂浮;用新洁尔灭消毒瓶口及瓶身;打开瓶口,再次用新洁尔灭消毒瓶口(可能会有液体溢出,注意不要碰到液体),酒精灯烤瓶口消毒;将培养液转移至50ml离心管或广口瓶中(若细胞漂浮严重,离心培养基,1000g*5分钟,将离心后的培养基转移至另一个大离心管中,留一点吹打细胞沉淀成悬液,回收细胞至原培养瓶),若漂浮不严重,亦离心一下;在原培养瓶中留一部分原装培养液,再补加自己新配的培养基至适当容积,例如4ml,让细胞适应一下环境。 当细胞长到70-80%,冻存大部分,小部分传代。
关键操作规范:
复苏流程:
快速解冻:37℃水浴中摇晃冻存管,5-10分钟内完成,加入4-6mL培养基离心去除DMSO37。
初始接种:细胞悬液置于T25瓶或6cm皿,24小时内贴壁伸展,48小时换液。
日常维护:
换液频率:每周2-3次,pH值稳定在7.0-7.4。
污染防控:严格无菌操作,定期检测支原体,使用双抗预防细菌污染。
异常处理:
贴壁失败:复苏24小时未贴壁的细胞存活率下降30%-50%,需弃用。
消化成团:吹打力度需轻柔均匀,避免机械损伤。
注意事项:
1)细胞漂浮:培养瓶不开封,瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。次日观察,如细胞大部分又贴回瓶底,表明细胞活力正常,剩余漂浮的细胞可以离心去掉,留10ml培养液培养观察,细胞生长至汇合度80%,进行消化传代;如细胞还是不贴壁,将细胞离心收集转到新培养瓶,原培养瓶加部分培养液继续培养,中间注意观察,我们的技术人员会一直跟踪指导,直到问题解决。
2)对于生长缓慢的贴壁细胞:可采用适当的提高培养基中血清浓度,或隔日换液的方法来保证细胞的状态和生长速度。