技术文章/ARTICLES

库蚊通用探针法荧光定量PCR试剂盒实验规则：

1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但有专业人员进行矫正。

2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。

3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。

4、实验时，要使底物避光保存。

5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。

6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。

7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。

8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。

9、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。

10、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。为确保实验数据的可靠性和可重复性，实验人员需严格遵守以下补充操作规范：

11. 反应体系配制应在超净工作台内完成，避免气溶胶污染。所有离心管需预先标号，并按试剂盒说明书精确配制预混液，使用前需瞬时离心去除管壁液滴。

12. 加样顺序应遵循"由低浓度到高浓度"原则，每加完一组标准品需更换新手套。建议在96孔板边缘设置阴性对照孔（加入无核酸酶水）和阳性对照孔（试剂盒提供标准品）。

13. 热循环仪需提前预热至工作温度，反应板装载时应确保密封膜覆盖孔口。建议使用离心机对反应板进行2000rpm/10秒离心，消除反应体系中的微小气泡。

14. 数据分析阶段需设置合理的阈值线，Ct值＞35的样本应视为可疑数据。当复孔Ct值差异＞1.5时，需重新提取核酸进行复测。所有原始数据应保存为仪器导出格式和Excel双备份。

15. 实验结束后需立即对工作台面进行紫外消毒，废弃枪头应浸泡于10%次氯酸钠溶液30分钟。未用完的试剂应按说明书要求分装冻存，避免反复冻融。

特别提示：当检测环境温度超过28℃时，建议在加样区放置冰盒保持试剂低温状态。对于临界值样本（Ct值32-35），建议采用巢式PCR方法进行验证，并将检测结果与临床症状相结合进行综合判断。实验记录应详细记载每批次试剂的货号及有效期，以便溯源核查。