ACP是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、酱油酿造、饲料等。
测定原理:
酸性条件下,ACP催化酪蛋白水解产生;在碱性条件下,还原磷钼酸化合物生成钨蓝;钨蓝在680nm有特征吸收峰,通过测定其吸光度增加,来计算ACP活性。
自备仪器和样品:
水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、0.5mL EP管和蒸馏水。
粗酶液提取:
1、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。16000g,4℃离心20min,取上清置冰上待测。
2、细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);16000g, 4℃离心20min,取上清液置冰上待测。
3、血清等液体:直接测定。
样本采集与保存注意事项:
动物肝脏等ADH富集样本需冰上快速采集,采集后立即液氮速冻,-80℃避光保存。
植物样本需液氮研磨后分装冻存,全程避免反复冻融,防止酶活性降解。
样本处理操作注意事项:
组织研磨全程在冰浴中进行,使用预冷研钵,间歇操作避免产热导致酶失活。
细胞裂解采用温和方式,超声波破碎需控制功率和时间,裂解液中添加蛋白酶抑制剂。
酶液需通过预实验系列稀释,确保反应在3-5分钟内保持线性区间。