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胰岛素对离体犊牛小肠上皮细胞增殖及吸收功能影响的实验

(一)试验原理

    新生哺乳动物胃肠道的生长发育非常迅速，这与初乳的摄入有关，初乳中含大量多肽类生长因子如胰岛素等。本实验通过体外犊牛小肠上皮细胞培养法，用细胞增殖率和葡萄糖吸收率作为细胞生长发育及功能成熟的指标，探讨胰岛素或其他生长因子对细胞生长发育的影响，同时为新生胃肠道营养发育生理研究提供研究方法。

(二)材料

1．待检药物胰岛素(o．01μg／ml、0．1μg／ml、1μg／ml、10μg／ml及50μg／m1)。

2．动物出生1日龄以内未吮乳的中国荷斯坦犊公牛。

3．试剂DMEM／F12培养液、DMSO、台盼蓝、15％NCS、葡萄糖。

4．器材37℃水浴箱、酶标仪。

(三)实验方法

1．细胞分离和培养出生1日龄以内未吮乳的中国荷斯坦犊公牛宰杀后放血，无菌条件下取十二指肠约10cm，迅速放人37℃生理盐水中。按照Evans方法制取小肠细胞，用染色法进行细胞计数，存活的细胞活力大于85％时可进行细胞培养。将细胞按1×105／ml接种于24孔培养板上，在37℃、5％CO2孵箱中培养。48h后更换为含不同浓度胰岛素(0．01μg／ml、O．1μg／ml、1μg／ml、lOμg／ml及50μg／ml)的DMEM／F 12培养液，用无血清培养液作为对照。继续培养72 h 后，测定细胞增殖率。

2．细胞增殖率的测定 各组细胞更换培养液培养。72h后，弃去培养液，每孔加入200μl无血清的DMEM／F12及200μl 0．05％MTT，在5％C02、37℃孵箱中培养4h，弃去培养液和MTT，每孔加入O．5ml DMSO，用酶标仪测定0D540。

3．葡萄糖吸收率的测定配制葡萄糖浓度为4mg／ml的生理盐水溶液，用其稀释胰岛素，使之浓度分别为O．Olμg／ml、O．1μg／m1、1μg／ml、10μg／ml及50μg／ml。细胞分离后在含15％NCS的DMEM／F12培养液中培养48h，分别用各实验组生理盐水孵育细胞30min，然后按试剂盒要求测葡萄糖吸收量(葡萄糖吸收量=总葡萄糖含量一剩余量)。

(四)结果与分析

浓度为O．01μg／ml的胰岛素作用很小，与对照组无显著性差异(P>0．05)，无促细胞增殖及促进细胞吸收葡萄糖的作用。随着浓度的增加，胰岛素的促增殖作用及促细胞吸收葡萄糖的作用逐渐增强。但当胰岛素浓度达到50μg／ml的超生理浓度时，胰岛素反而抑制细胞增殖，并抑制细胞吸收葡萄糖。